XerumFree™用于最佳無血清細(xì)胞培養(yǎng)的*定義的添加劑。

XerumFree™ 被開發(fā)用于添加到基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基中以替代胎牛血清。它*不含動(dòng)物和人類衍生的化合物。

當(dāng)質(zhì)量和一致性很重要時(shí)，XerumFree™ 是一個(gè)好的選擇。

tncbio XerumFree說明書

XerumFree易于使用：

只需像使用FBS（通常為10%）一樣將XerumFree添加到培養(yǎng)基中即可。要從含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變?yōu)楹琗erumFree的培養(yǎng)基，我們建議按照使用手冊（可根據(jù)要求提供，或從我們的網(wǎng)站下載）中所述的步驟進(jìn)行細(xì)胞斷奶

在無干燥濃縮培養(yǎng)基上成功培養(yǎng)的細(xì)胞示例：

•肝上皮細(xì)胞•HaCaT

•原代人肝細(xì)胞•雜交瘤

•維羅•HEK293

•CHO•HEP G2

•HeLa•等。

•人類角質(zhì)形成細(xì)胞

Catalog number      Volume                  Product

XF212-0100           100 ml                    XerumFree

XF212-0500           500 ml                    XerumFree

XF212-xxxx           on request / customized XerumFree

defined cellculture

XerumFree™ XF212 Medium Supplement.

完整定義、無動(dòng)物成分的細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充劑。

在沒有血清的情況下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)可能很有挑戰(zhàn)性。然而，這些回報(bào)在很大程度上是對這些努力的回報(bào)，重新發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)很快發(fā)展成為一種激情。本文的目的是引導(dǎo)用戶順利過渡到無血清狀態(tài)，并避免所有不充分或不適當(dāng)?shù)呐Α?/span>

理想情況下，向無血清條件的轉(zhuǎn)化應(yīng)進(jìn)行多次傳代，以逐漸選擇可在無血清條件下生長的細(xì)胞。然而，如果所有關(guān)鍵方面都得到適當(dāng)解決，直接適應(yīng)無血清環(huán)境也可能成功。

無論采用何種方法，關(guān)鍵問題包括細(xì)胞接種物的生長狀態(tài)、細(xì)胞接種密度、亞培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的生物物理屬性。

TNCbio的XerumFree™ 血清替代物的設(shè)計(jì)目的是以與傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)血清相同的方式使用，作為培養(yǎng)基補(bǔ)充。

使用濃縮防靜電劑前的重要注意事項(xiàng)™ XF212：

-XF212是一種替代血清的細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑，因此它不是

最后一道菜。

-XF212必須添加到基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基中（例如IMDM、DMEM-F12或任何其他選擇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基）。

-XF212不含細(xì)胞因子、激素等生長因子。

因此也沒有胰島素*。

內(nèi)容：

1準(zhǔn)備

1.1細(xì)胞培養(yǎng)基的一般制備

1.2無血清條件下的一般適應(yīng)方法

1.2.1直接適應(yīng)

1.2.2順序適應(yīng)

2使用XF212

2.1細(xì)胞系

2.1.1錨定依賴性細(xì)胞系

2.1.2非錨定細(xì)胞系

1. 準(zhǔn)備XF212

   1.1無血清細(xì)胞的一般制備

   培養(yǎng)基

   輕輕搖動(dòng)免靜電瓶™ 使用前不久。

   添加XerumFree™ 與血清濃度相同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（例如10%）。

   在這個(gè)階段不要添加任何抗生素。事實(shí)上，抗生素和許多化合物一樣，與血清的血漿蛋白結(jié)合，尤其是與白蛋白部分結(jié)合。

   因此，在無血清和無白蛋白的條件下，相同濃度的抗生素將表現(xiàn)出更高的生物活性，這種活性的增加可能會(huì)對細(xì)胞生長產(chǎn)生有害影響。

   如果認(rèn)為“無抗生素培養(yǎng)”不可行，建議使用濃度為50 mg/l的慶大霉素。

   *一些用戶更喜歡或需要在沒有胰島素的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。如果是無靜電的™ 是否使用胰島素（和/或其他生長因子）培養(yǎng)細(xì)胞的決定權(quán)在你。如果細(xì)胞生長和性能需要胰島素，我們建議在1.25 mg/l的最終細(xì)胞培養(yǎng)基中添加重組胰島素。

    

1.2無血清條件下的一般適應(yīng)方法

基本上有兩種方法可以使細(xì)胞適應(yīng)無血清環(huán)境中的生長：

1.2.1直接適應(yīng)

這是通過將細(xì)胞從含血清培養(yǎng)基直接轉(zhuǎn)移到無血清培養(yǎng)基來實(shí)現(xiàn)的。

1.2.2順序適應(yīng)或斷奶方法將細(xì)胞從含有原始血清的培養(yǎng)基中依次通過以下階段，其中每個(gè)步驟將添加血清的培養(yǎng)基減半，從而將無血清培養(yǎng)基增加至大約低于以下值：

第一階段：

50%無干補(bǔ)充培養(yǎng)基/50%血清補(bǔ)充培養(yǎng)基

第二階段：

75%無干燥補(bǔ)充培養(yǎng)基/25%血清補(bǔ)充培養(yǎng)基

第三階段：

87.5%無干補(bǔ)充培養(yǎng)基/12.5%血清補(bǔ)充培養(yǎng)基

第四階段：

93.75%無干補(bǔ)充培養(yǎng)基/6.25%血清補(bǔ)充培養(yǎng)基

第五階段：

96.88%無干補(bǔ)充培養(yǎng)基/3.12%血清補(bǔ)充培養(yǎng)基

第6階段：

98.44%無干補(bǔ)充培養(yǎng)基/1.56%血清補(bǔ)充培養(yǎng)基

第7階段：

無干燥補(bǔ)充培養(yǎng)基

如果增長率下降，后退一步，在再次增長后繼續(xù)。

細(xì)胞培養(yǎng)可能包括細(xì)胞系（貼壁或懸浮生長）或原代培養(yǎng)。此外，從功能的角度來看，細(xì)胞類型可能會(huì)發(fā)生不同程度的分化，或者表現(xiàn)出未分化的特征，比如干細(xì)胞制劑。

在每種情況下，適應(yīng)協(xié)議都必須考慮到細(xì)胞類型的特定要求，以確保獲得最佳成功機(jī)會(huì)。

2.XF212的使用

2.1細(xì)胞系

以下協(xié)議適用于正常（二倍體，有限壽命）或轉(zhuǎn)化或永生化細(xì)胞系（生命周期不確定）。

2.1.1錨定依賴性細(xì)胞系

關(guān)鍵成功因素：

-細(xì)胞培養(yǎng)載體的涂層可實(shí)現(xiàn)最佳細(xì)胞附著

-盡量減少胰蛋白酶的作用

-抗生素系統(tǒng)的選擇

實(shí)驗(yàn)步驟：

A） 使用以下方法在細(xì)胞培養(yǎng)表面涂抹足夠的細(xì)胞附著因子：

-一種商用涂層試劑盒，如Pronectin™ F、 MapTRIX™ 或同等標(biāo)準(zhǔn)。

-纖維連接蛋白或聚賴氨酸涂層，或

-少量FBS（例如，T25燒瓶為500μl），在37°C下培養(yǎng)過夜，然后用PBS或新鮮培養(yǎng)基洗滌兩次。

-即用塑料可改善粘附細(xì)胞的附著。

B） 分離細(xì)胞單層

-在缺乏含有胰蛋白酶抑制劑的血清的情況下，標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶制劑的使用可能會(huì)出現(xiàn)一些問題。它是

因此，在無血清條件下盡可能降低殘余胰蛋白酶的蛋白水解活性，以避免對細(xì)胞造成不可逆的損傷是非常重要的。

這可以通過使用胰蛋白酶抑制劑（例如來自大豆）或使用非哺乳動(dòng)物解離試劑（例如

Accutase™ 在傳代過程中不需要滅活或去除?；蛘?，細(xì)胞顆粒的額外洗滌步驟將去除大部分剩余的胰蛋白酶。然而，這個(gè)過程意味著額外的離心步驟，可能會(huì)對某些細(xì)胞類型造成損害。

-我們的偏好是：*忘記胰蛋白酶，使用Accutase™ 還是脫附™ 分離細(xì)胞單層；這些細(xì)胞分離解決方案

能夠滿足貼壁細(xì)胞溫和有效分離的苛刻

要求；細(xì)胞膜和表面表位不會(huì)受到損害，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能質(zhì)量也不會(huì)受到影響

表面蛋白質(zhì)保持完整。

C） 每平方厘米20000個(gè)細(xì)胞的種子細(xì)胞

在根據(jù)第1點(diǎn)制備的完整培養(yǎng)基中。

-在試驗(yàn)的第一步，觀察高播種密度是很重要的

適應(yīng)過程。細(xì)胞通常分泌一系列因子

進(jìn)入控制細(xì)胞附著、生長和增殖的培養(yǎng)基。然而，在播種階段，這些因素在土壤中是不存在的

新鮮無血清培養(yǎng)基和臨界水平的細(xì)胞密度對于誘導(dǎo)這些自分泌/旁分泌因子的立即充分產(chǎn)生至關(guān)重要。

D） 在37°C下培養(yǎng)并保持細(xì)胞培養(yǎng)物，直到它們達(dá)到80-90%的融合率。

-在此期間，每2-3天更換75%的培養(yǎng)基。不要丟棄用過的培養(yǎng)基。

取而代之的是收集條件培養(yǎng)基、無菌過濾器，并在4°C下放置，以便在接下來的步驟中使用。如果細(xì)胞在任何時(shí)候似乎停滯了，讓它們有更多的時(shí)間適應(yīng)新的無血清環(huán)境。

E） 當(dāng)達(dá)到接近融合時(shí)，以1:2或1:3的比例分裂細(xì)胞。

-這是XerumFree中的第二段™ 不需要涂層，但強(qiáng)烈建議使用條件培養(yǎng)基-該培養(yǎng)基部分確實(shí)包含調(diào)節(jié)附著、擴(kuò)散、生長和生長的自分泌因子

激增在前一代收集的由75%新鮮培養(yǎng)基+25%條件培養(yǎng)基組成的混合物中的種子細(xì)胞。

繼續(xù)每2-3天向細(xì)胞提供75%的新鮮培養(yǎng)基，并按照上述d）收集條件培養(yǎng)基。

F） 重復(fù)步驟E），直到細(xì)胞表現(xiàn)出與之前在補(bǔ)充血清的培養(yǎng)基中的生長相當(dāng)?shù)纳L動(dòng)力學(xué)。

-在這一點(diǎn)上，細(xì)胞系可以被認(rèn)為是*適應(yīng)的。這可能總共需要4-6段。

G） 從這一點(diǎn)開始，抗生素可以添加到培養(yǎng)基中。

-我們建議使用廣譜抗生素慶大霉素；與標(biāo)準(zhǔn)抗生素相比，這種抗生素的細(xì)胞毒性大大降低

青霉素/鏈霉素雞尾酒。慶大霉素的建議使用濃度為50 mg/l。

H） 一旦調(diào)整，可以應(yīng)用原始分割比率（在補(bǔ)充血清的條件下）。

2.1.2非錨定細(xì)胞系

以下方案適用于已經(jīng)懸浮生長的細(xì)胞系。用于貼壁細(xì)胞對無干細(xì)胞的適應(yīng)™ 懸浮生長，請參閱TNC BIO的技術(shù)說明“細(xì)胞從單層到無血清懸浮培養(yǎng)的適應(yīng)性”。

關(guān)鍵成功因素：

抗生素系統(tǒng)的選擇

實(shí)驗(yàn)步驟

A） 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到3-5 x 106個(gè)細(xì)胞/毫升（取決于細(xì)胞系）時(shí)，開始切換到無干燥狀態(tài)™ 補(bǔ)充中等。

收獲細(xì)胞懸浮液，取出一小份進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并以200 g離心整個(gè)懸浮液5分鐘。

B） 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

C） 將細(xì)胞顆粒重新放置在無干燥的環(huán)境中™ 以106個(gè)細(xì)胞/毫升的密度補(bǔ)充培養(yǎng)基。

在適應(yīng)過程的最初階段，觀察高播種密度很重要。

細(xì)胞通常會(huì)向培養(yǎng)基中分泌一系列因子來控制細(xì)胞的生長和增殖。然而，在播種階段，這些因素在新鮮無血清培養(yǎng)基中不存在，細(xì)胞密度的臨界水平是

對于誘導(dǎo)這些自分泌/旁分泌因子的立即充分產(chǎn)生至關(guān)重要。

D） 在37°C下培養(yǎng)并保持細(xì)胞培養(yǎng)物，直到其密度達(dá)到約3-5 x 106個(gè)細(xì)胞/毫升。

E） 以1:3或1:4的比例拆分懸浮培養(yǎng)物，方法是添加適當(dāng)體積的新鮮培養(yǎng)基（例如，25毫升細(xì)胞懸浮液+75毫升無水培養(yǎng)基）™ 補(bǔ)充培養(yǎng)基，放入4個(gè)單獨(dú)的培養(yǎng)基中

船只）

F） 重復(fù)步驟E）直到培養(yǎng)物顯示出最初在補(bǔ)充血清的培養(yǎng)基中的生長動(dòng)力學(xué)。從那時(shí)起，細(xì)胞系可以考慮

*適應(yīng)，并可在補(bǔ)充血清培養(yǎng)期間按原始比例拆分。

G） 從這一點(diǎn)開始，抗生素可以添加到培養(yǎng)基中。

我們建議使用濃度為50毫克/升的慶大霉素；與標(biāo)準(zhǔn)的青霉素/鏈霉素雞尾酒相比，這種抗生素的細(xì)胞毒性要低得多。